style="width:3.09994in" />GB/T 34799—2017 本文是学习GB-T 34799-2017 几丁质酶活性检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、灰色链霉菌(Streptomyces
griseus)和绿色木
霉(Trichoderma viride)发酵生产的几丁质酶活性检测方法。
本标准适用于生化试剂、工业产品中几丁质酶活性的测定。
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件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
几丁质酶活性单位 chitinase activity unit
在37℃,pH6.0 时，通过β-N-
乙酰氨基葡萄糖苷酶辅助的两步反应，每分钟催化生成1 mg N-乙
酰葡萄糖的几丁质酶量为一个活力单位，单位为 U。
几丁质酶能迅速催化几丁质水解为 N- 乙酰葡萄糖或由 N-
乙酰葡萄糖构成的双糖和寡糖，双糖和 寡糖在 βN-
乙酰氨基葡萄糖苷酶的辅助下继续水解为可由吸光度法检测的N-
乙酰葡萄糖，通过外标
法计算 N- 乙酰葡萄糖生成量测得酶活性。
5.2 电子天平：感量0.0001 g。
5.3 分光光度计：吸光度值精确至0.001。
5.5 恒温震荡摇床：控温精度±0.5℃。
本标准所使用的试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 中规定的二级水。
GB/T 34799—2017
6.1 溶液 A:200 mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH 6.0
磷酸氢二钾0.459g,磷酸二氢钾2.36 g,加入90mL 水，用1 mol/L
的氢氧化钾或盐酸调节 pH 至
6.0,定容至100 mL。
6.2 溶液 B:12.5 mg/mL几丁质悬浊液
称取粉末状几丁质5.0 g,缓慢加入200mL(≤4℃)
预冷的37%的盐酸中，在磁力搅拌器上剧烈搅
拌，待几丁质基本上溶解完毕且溶液变为清亮的黄色时，于4℃冰箱沉淀过夜。将上清液倒入
2000mL 的水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30 min
后停止搅拌，将悬浮液置于4℃冰
箱沉淀过夜。倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，至滤液
pH 达到5.5 以上。将上述沉淀物加到50 mL
的水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质悬浊液。取该悬浊液 5mL,105℃
烘箱干燥至衡重，测定所制备的几丁质悬浊液浓度。该悬浊液可于4℃放置3个月，临用
前剧烈震荡摇匀，用溶液 A 稀释至12.5 mg/mL。
6.3 溶液 C:2.5 mol/L酒石酸钾钠溶液
称取28.22 g 四水酒石酸钾钠(KNaC₁H₁O₅ ·4H₂O), 加入40 mL 的2 mol/L
氢氧化钠溶液。
100℃水浴加热，不可直接煮沸。
6.4 溶液 D:96 mmol/L 3,5-二硝基水杨酸溶液
称取1.1 g 的3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic Acid),加入50 mL
水、100℃水浴加热溶解，
不可直接煮沸。
缓慢搅拌将溶液 C 和溶液 D 混匀。用水稀释到100 mL。
若未完全溶解，试剂应该在混匀时溶解。
试剂置于棕色瓶中，室温保存，稳定保存6个月。
6.6 溶液 F:10 mmol/L对硝基苯-N- 乙酰-
β-D-氨基葡萄糖苷溶液(PNP-NAG)
称取342 . 3 mg 对 硝 基 苯 -N- 乙酰- β-D-氨 基 葡 萄 糖 苷
(p-Nitrophenyl N-Acetyl- β-D-
Glucosaminide,PNP-NAG), 用水定容至100 mL。
6.7 溶液 G:β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶溶液
用溶液 A 配置 βN- 乙酰氨基葡萄糖苷酶(
βN-Acetylglucosaminidase)的溶液，现用现配，并按以
下方法调整酶浓度：所有试剂使用前在37℃恒温箱中平衡30 min。 取 1 μLβN-
乙酰氨基葡萄糖苷酶 溶液加入1.25 mL 溶液 A 中，再加入1.25 mL
溶液F,快速混匀后于分光光度计400 nm 波长下，测定 初始时和37℃恒温反应10
min 后的吸光度值，两者之差即为△A。 调整酶浓度至△A 在0.16～0.20
之间。
6.8 溶液 H:0.5 mg/mL N-乙酰-D-葡萄糖胺标准溶液
称取0.05 g 的 N- 乙酰-D-葡萄糖胺(N-Acetyl-D-Glucosamine,NAG),
用水定容至100 mL。
GB/T 34799—2017
称取10 mg 样品，精确至0.1 mg, 加入溶液A
至固体样品完全溶解，并适当稀释，使得最后的溶液
中含有0.8 U/mL～1.0 U/mL 的酶活力。
将液体酶样适当稀释，使得最后的溶液中含有0.8 U/mL～1.0 U/mL 的酶活力。
取2只离心管，其中样液处理管加入0.8 mL 溶液 B,0.2mL
试验液。空白对照管加入0.8 mL 溶 液 B,0.2mL
水。盖紧离心管，涡旋震荡，使几丁质保持悬浊状态。样液处理管和空白对照管在37℃
反应2 h。 反应结束后，100℃水浴终止反应，冷水浴冷却到37℃。每管中加入0.16
mL 的溶液 G,
37℃涡旋震荡反应30 min。 离心后取上清。
取8只离心管，分别标记为0号～5号管、样液测试管和空白测试管。0号～5号管用于绘制标准
曲线，加样方法如表1所示。样液测试管加入0.5 mL 样液处理管上清液，1.0 mL
水，0.75 mL 溶液 E。 空白测试管取0.50 mL 空白对照管上清，1.0 mL 水，0.75
mL 溶液 E。100℃ 水 浴 5 min。 结束后冷却
到室温，在540 nm 处测吸光度值，记录每管的As40m。
表 1 标准曲线加样方法
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1号～5号管△As4nm为其A54nm与0号管As40nm的差值。1号～5号管对应的 N-
乙酰葡萄糖量分
别为0.05 mg、0.10 mg、0.15 mg、0.20 mg、0.25 mg。 以1号～5号管对应的 N-
乙酰葡萄糖量为横坐
标，△A540m 为纵坐标，采用最小二乘法拟合线性回归方程。样品的△As₀m
为样品测试管A5m 与空白
测试管A540m 的差值。通过标准曲线计算生成的 N- 乙酰葡萄糖的量 m₁。
style="width:3.09994in" />GB/T 34799—2017
式中：
style="width:2.44669in;height:0.6534in" />
……………………
(1)
X —— 几丁质酶活性，单位为酶活力单位每毫升(U/mL);
m₁- 由标准曲线计算出催化生成的 N- 乙酰葡萄糖的质量，单位为毫克(mg);
d —— 样品稀释倍数；
1.16— 样液处理管反应液最终体积，单位为毫升(mL);
120——反应时间，单位为分钟(min);
0.5 ——取样液处理管上清的体积，单位为毫升(mL);
0.2 — 参与反应的试验液体积，单位为毫升(mL)。
计算结果保留三位有效数字。
style="width:3.11331in;height:0.6534in" /> (2)
式中：
X — 几丁质酶活性，单位为酶活力单位每克(U/g);
m₁ - 由标准曲线计算出催化生成的 N- 乙酰葡萄糖的质量，单位为毫克(mg);
V — 样品溶解液体积，单位为毫升(mL);
d — 样品稀释倍数；
m₂— 样品质量，单位为克(g);
1.16——样液处理管反应液最终体积，单位为毫升(mL);
120——反应时间，单位为分钟(min);
0.5 ——取样液处理管上清的体积，单位为毫升(mL);
0.2 - 参与反应的试验液体积，单位为毫升(mL)。
计算结果保留三位有效数字。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果差值的绝对值不得超过算术平均值的10%。
更多内容 可以 GB-T 34799-2017 几丁质酶活性检测方法. 进一步学习